Dvouřetězcová RNA (dsRNA) ELISA KIT

Tato souprava je enzymatická imunoanalýza (ELISA) spojená se systémem biotin-streptavidin pro kvantitativní měření dsRNA s délkou nad 60 párů bází (bp), bez ohledu na sekvenci.Destička byla předem potažena anti-dsRNA protilátkou.Přidá se dsRNA přítomná ve vzorku a naváže se na protilátky potažené na jamkách.A pak se přidá biotinylovaná anti-dsRNA protilátka a naváže se na dsRNA ve vzorku.Po promytí se přidá HRP-Streptavidin a naváže se na biotinylovanou anti-dsRNA protilátku.Po inkubaci se nenavázaný HRP-Streptavidin odmyje.Poté se přidá roztok substrátu TMB a katalyzuje se HRP za vzniku modrého produktu, který se po přidání kyselého zastavovacího roztoku změní na žlutý.Hustota žluté je úměrná cílovému množství dsRNA zachycené v destičce.Absorbance se měří při 450 nm.

aplikace

Tato sada je určena pro kvantitativní měření zbytkové dsRNA.

Součásti stavebnice

Skladování a stabilita

1. Pro nepoužitou soupravu: Celou soupravu lze skladovat při teplotě 2~8 °C po dobu skladovatelnosti.Pro stabilitu při skladování je třeba se vyhnout silnému světlu.

2. Pro použitou soupravu: Jakmile je mikrodestička otevřena, zakryjte nepoužité jamky utěsněním destiček a vraťte je do fóliového sáčku obsahujícího vysoušecí balíček, fóliový sáček uzavřete zipem a co nejdříve po použití vraťte do 2~8°C.Ostatní reagencie by měly být co nejdříve po použití vráceny na 2~8°C.

Požadovaný materiál, který není součástí dodávky

1. Čtečka mikrodestiček s filtrem 450±10nm (lepší, pokud dokáže detekovat při vlnové délce 450 a 650 nm).

2. Mikrotitrační třepačka.

3. Špičky a centrifugační zkumavky bez RNázy.

Provozní vývojový diagram

Než začnete

1. Před použitím vytemperujte všechny součásti soupravy a vzorky na pokojovou teplotu (18-25 °C).Pokud soupravu nespotřebujete najednou, vyjměte prosím pouze proužky a činidla pro současný experiment a zbývající proužky a činidla ponechejte v požadovaném stavu.

2. Promývací pufr: zřeďte 40 ml 20× koncentrovaného promývacího pufru se 760 ml deionizované nebo destilované vody, abyste připravili 800 ml 1× promývacího pufru.

3. Standard: před použitím zásobní roztok krátce odstředit nebo odstředit.Koncentrace čtyř poskytnutých standardů je 5 ng/μL.Pro standardy UTP a pUTP dsRNA zřeďte zásobní roztok na 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL pufrem STE, abyste nakreslili standardní křivku.Pro standardy N1-Me-pUTP dsRNA zřeďte zásobní roztok na 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0 pg/μl pufrem STE, abyste nakreslili standardní křivku.Pro standard 5-OMe-UTP dsRNA zřeďte zásobní roztok na 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0 pg/μL pufrem STE, abyste nakreslili standardní křivku.Doporučujeme standardy ředit podle následujících tabulek:

4. Biotinylovaná detekční protilátka a pracovní roztok HRP-streptavidin: zásobní roztok před použitím krátce odstřeďte nebo odstřeďte.Zřeďte je na pracovní koncentraci ředícím pufrem.

5. Substate TMB: nasajte potřebnou dávku roztoku pomocí sterilizovaných špiček a zbytkový roztok znovu nevylévejte do lahvičky.Substate TMB je citlivý na světlo, nevystavujte substrát TMB světlu po dlouhou dobu.

Pomocí protokolu

1. Určete počet proužků potřebných pro test.Pro použití vložte proužky do rámečků.Zbývající proužky destičky, které nebyly použity v tomto testu, by měly být znovu zabaleny do sáčku s vysoušedlem.Pro skladování v chladničce sáček pevně uzavřete.

2. Do příslušných jamek přidejte 100 μl každého z ředění standardu, slepého pokusu a vzorků.Zakryjte těsnicím prostředkem na desky.Inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě za třepání při 500 ot./min.Vzorky by měly být zředěny STE pufrem na vhodnou koncentraci pro přesný test.

3. Krok promývání: Nasajte roztok a promyjte 250 μL promývacího pufru do každé jamky a nechte 30 sekund stát.Promývací pufr zcela zlikvidujte přichycením destičky na savý papír.Úplně 4x vyprat.

4. Do každé jamky přidejte 100 μl pracovního roztoku biotinylované detekční protilátky.Zakryjte těsnicím prostředkem na desky.Inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě za třepání při 500 ot./min.

5. Opakujte krok mytí.

6. Do každé jamky přidejte 100 μl pracovního roztoku HRP-streptavidinu.Zakryjte těsnicím prostředkem na desky.Inkubujte 30 minut při pokojové teplotě s třepáním při 500 ot./min.

7. Znovu opakujte krok mytí.

8. Do každé jamky přidejte 100 μl roztoku substrátu TMB.Zakryjte těsnicím prostředkem na desky.Inkubujte 30 minut při teplotě místnosti Chraňte před světlem.Kapalina zmodrá přidáním roztoku substrátu.

9. Do každé jamky přidejte 50 μl zastavovacího roztoku.Kapalina zežloutne přidáním zastavovacího roztoku.Poté spusťte čtečku mikrodestiček a okamžitě proveďte měření při 450 nm.

Výpočet výsledků

1. Zprůměrujte duplicitní hodnoty pro každý standard, kontrolu a vzorky a odečtěte průměrnou optickou hustotu nulového standardu.Sestrojte standardní křivku s absorbancí na vertikální (Y) ose a koncentrací dsRNA na horizontální (X）ose).

2. Doporučuje se provést výpočet pomocí počítačového softwaru pro prokládání křivek, jako je curve expert 1.3 nebo ELISA Calc v 5 nebo 4parametrovém nelineárním prokládacím modelu.

Výkon

1. Citlivost:

dolní hranice detekce: ≤ 0,001 pg/μL (pro UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (pro 5-OMe-UTP-dsRNA).

dolní mez kvantifikace:0,0156 pg/μL (pro UTP-, pUTP-dsRNA),0,0312 pg/μL (pro N1-Me-pUTP-dsRNA),0,0625 pg/μL (pro 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Přesnost: CV intra-testu ≤ 10 %, CV Inter-Assay ≤ 10 %

3. Výtěžnost: 80 %~120 %

4. Linearita: 0,0156-0,5 pg/μL (pro UTP-,pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (pro N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (pro 5-OMe-UTP-dsRNA).

Úvahy

1. Reakční teplota a čas TMB jsou kritické, řiďte je prosím přísně podle pokynů.

2. Pro dosažení dobré reprodukovatelnosti a citlivosti testu je nezbytné správné promytí destiček, aby se odstranily přebytečné nezreagované reagencie.

3. Všechny reagencie by měly být před použitím důkladně promíchány, aby se během přidávání vzorku nebo reagencií netvořily bublinky.

4. Pokud se v koncentrovaném promývacím pufru (20x) vytvořily krystaly, zahřejte na 37 °C a jemně míchejte, dokud se krystaly úplně nerozpustí.

5. Vyhněte se testování vzorků obsahujících azid sodný (NaN3), protože by mohl zničit aktivitu HRP, což by mělo za následek podhodnocení množství dsRNA.

6. Během testu zabraňte kontaminaci RNázou.

7. Standard/vzorek, detekční protilátku a SA-HRP lze také provést při teplotě místnosti bez třepání, ale to může způsobit jednonásobné snížení citlivosti detekce.Pro tento případ doporučujeme standardy UTP a pUTP dsRNA naředit z 2 pg/μl, standardy N1-Me-pUTP dsRNA naředit z 4 pg/μl a standard 5-OMe-UTP dsRNA naředit z 8 pg/μl.Kromě toho inkubujte pracovní roztok HRP-streptavidin po dobu 60 minut při pokojové teplotě.Nepoužívejte třepačku baněk, protože třepačka může vést k nepřesným výsledkům.

Typický výsledek

1. Data standardní křivky

2. Výpočet standardní křivky

3. Rozsah detekce vložky: 0,0312- 1 pg/μL