M-MLV reverzní transkriptáza
RevScript Reverzní transkriptáza se získává technologií genetického inženýrství.Má vyšší schopnost syntézy cDNA, tepelnou stabilitu a limit reakční teploty (do 60°C).Syntetizovaný produkt cDNA má až 10 kb.Zvyšuje afinitu templátů a je vhodný pro reverzní transkripci RNA templátů se složitou sekundární strukturou nebo geny s nízkým počtem kopií.
Komponenty
| Komponent | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10 000U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript reverzní transkriptáza (200 U/μL) | 50 μL | 5×50 μl | 1 ml |
| 5 × vyrovnávací paměť RevScript | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Skladovací stav
Tento produkt by měl být skladován při -25°C~-15°C po dobu 2 let.
Definice jednotky
Jedna jednotka inkorporuje 1 nmol dTTP do materiálu nerozpustného v kyselině během 10 minut při 37 °C s použitím Oligo(dT) jako primerů.
Nastavení reakce
1.Denaturace templátu RNA (Tento krok je volitelný, denaturace templátu RNA pomáhá otevřít sekundární struktury, což zlepší výtěžek prvního vlákna cDNA.)
| Komponenty | Hlasitost (μL) |
| ddH bez RNázy2O | Do 13 |
| oligo (dT)18 (50 μmol/L) nebo Random Primer (50 μmol/L) Nebo genově specifické primery (2 μmol/l) | 1 |
| nebo 1 | |
| nebo 1 | |
| RNA templát | X a |
Poznámky:
1) a: Celková RNA: 1-5 ug nebo mRNA: 1-500 ng
2) Inkubace při 65 °C po dobu 5 minut, poté okamžité přenesení na led, aby se na 2 minuty zchladilo.Krátkou centrifugací shromážděte reakční kapalinu a přidejte reakční roztok pro reverzní transkripci, jak je uvedeno v následující tabulce.Jemně promíchejte pipetou.
1.Příprava reakční směsi (objem 20 μL)
| Komponenty | Hlasitost (μL) |
| Směs z předchozího kroku | 13 |
| 5×Vyrovnávací paměť | 4 |
| Směs dNTP (10nmol/l) | 1 |
| Reverzní transkriptáza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNázy (40 U/μL) | 1 |
1.Reakci proveďte za následujících podmínek:
| Teplota (°C) | Čas |
| 25 °Ca | 5 minut |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85 °Cc | 5 minut |
Poznámky:
1) a.Inkubace při 25 °C po dobu 5 minut je nutná pouze pro použití náhodných hexamerů.Při použití Oligo (dT) tento krok přeskočte18nebo Gene Specific Primer.
2) b.Doporučená teplota reverzní transkripce je 42°C. U templátů s komplikovanými sekundárními strukturami nebo vysokým obsahem GC se doporučuje zvýšit reakční teplotu na 50-55°C.
3) c.Zahřívání na 85 °C po dobu 5 minut pro inaktivaci reverzní transkriptázy.
4) Produkt lze přímo použít v reakcích PCR nebo qPCR nebo jej lze krátkodobě skladovat při -20 °C.Pro dlouhodobé skladování se doporučuje produkty zarovnat a skladovat při -80°C.Vyhněte se častému zmrazování a rozmrazování.
5) Produkt je vhodný pro jednokrokovou RT-qPCR, doporučuje se přidat 10-20 U reverzní transkriptázy na každých 25μL reakčního systému nebo postupně zvyšovat množství reverzní transkriptázy podle aktuální situace.
Poznámky
1.Udržujte experimentální oblast v čistotě;Během provozu je třeba používat čisté rukavice a masky.Všechny spotřební materiály použité v experimentu by měly být bez RNázy, aby se zabránilo kontaminaci RNázou.
2.Všechny postupy by měly být prováděny na ledu, aby se zabránilo degradaci RNA.
3.Pro zajištění vysoké účinnosti reverzní transkripce se doporučují vysoce kvalitní vzorky RNA.
4.Tento produkt je určen pouze pro výzkumné účely.
5.Pro vaši bezpečnost prosím používejte laboratorní pláště a jednorázové rukavice.
