mRNA Cap2'-O-methyltransferáza

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferáza byla odvozena z rekombinantního kmene E. coli, který nese gen pro mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasu vakcínie.Tento enzym přidává methylovou skupinu na pozici 2´-O prvního nukleotidu přilehlého ke struktuře čepičky na 5´konci RNA. Enzym využívá S-adenosylmethionin (SAM) jako donor methylu k methylaci zavíčkované RNA (cap -0), což má za následek strukturu cap-1.

Struktura Cap1 může zvýšit účinnost translace zlepšením exprese mRNA v experimentech transfekce a mikroinjekce. Tento enzym specificky vyžaduje RNA s čepičkou m7GpppN jako substrátem.Nemůže využít RNA s pN, ppN, pppN nebo GpppN na 5' konci.Čapovaná RNA může být připravena in vitro transkripcí s použitím cap analogu nebo pomocí enzymatického cappingu za použití Vaccinia Capping Enzyme.

Komponenty

mRNA Cap 2´-O-methyltransferáza (50 U/μL)

10×Uzavření reakčního pufru

Úložný prostor

-25 ～- 15 ℃ pro skladování （Vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování a rozmrazování）

Vyrovnávací paměť úložiště

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Definice jednotky

Jedna jednotka je definována jako množství enzymu potřebného k methylaci 10 pmolů 80 nt capated RNA transkriptu za 1 hodinu při 37 °C.

Testy kontroly kvality

Exonukleáza:50 U mRNA Cap 2'-O-Methyltransferasy s 1 μg λ-Hind III štěpené DNA při 37 °C po dobu 16 hodin nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

Endonukleáza: 50 U mRNA Cap 2´-O-Methyltransferasy s 1 μg λDNA při 37 °C po dobu 16 hodin nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2'-O-Methyltransferasy s 1 μg pBR322 při 37 °C po dobu 16 hodin nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

RNáza: 50 U mRNA Cap 2´-O-Methyltransferasy s 1,6 μg MS2 RNA po dobu 4 hodin při 37 °C nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2´-O-Methyltransferasy se vyšetřuje na přítomnostE. coli genomové DNA pomocí TaqMan qPCR s primery specifickými proE. coli 16S rRNA lokus.TheE. coli kontaminace genomové DNA je =1E. coli genom.

Bakteriální endotoxin: LAL-test, podle Chinese Pharmacopoeia IV 2020 edition, gelová limitní testovací metoda, obecné pravidlo (1143).Obsah bakteriálního endotoxinu by měl být =10 EU/mg.

Reakční systém a podmínky

1. Smíchejte vhodné množství Capped RNA a H2O bez RNázy v 1,5ml mikrocentrifugační zkumavce do konečného objemu 16,0 µl.

2. Zahřívejte na 65 °C po dobu 5 minut a poté na ledovou lázeň po dobu 5 minut.

3. Přidejte následující složky v uvedeném pořadí (pro methylaci cappované RNA

méně než 10

*10x Zakrývací reakční pufr: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Inkubujte při 37 °C po dobu 1 hodiny (2 hodiny inkubace se doporučují pro cílový fragment menší než 200 nt).

Aplikace

Pro zlepšení exprese mRNA během experimentů s mikroinjekcí a transfekcí.

Poznámky k použití

1. Před reakcí by měla být RNA purifikována a rozpuštěna ve vodě bez nukleázy, všechny roztoky by neměly obsahovat žádnou EDTA a ionty.

2. Před reakcí se doporučuje zahřát vzorek RNA na 65°C po dobu 5 minut, aby se odstranila sekundární struktura na 5´konci transkriptu.U složité 5´-terminální struktury by to mohlo být prodlouženo na 10 minut.