PNGase F
Peptid-N-glykosidáza F (PNGáza F) je nejúčinnější enzymatická metoda pro odstranění téměř všech N-navázaných oligosacharidů z glykoproteinů.PNGáza F je amidáza, která štěpí mezi nejvnitřnějšími GlcNAc a asparaginovými zbytky vysoce manosových, hybridních a komplexních oligosacharidů z N-vázaných glykoproteinů.
aplikace
Tento enzym je užitečný pro odstranění sacharidových zbytků z proteinů.
Příprava a specifikace
| Vzhled | Bezbarvá kapalina |
| Čistota bílkovin | ≥95 % (z SDS-PAGE) |
| Aktivita | ≥500 000 U/ml |
| Exoglykosidáza | Nebyla zjištěna žádná aktivita (ND) |
| Endoglykosidáza F1 | ND |
| Endoglykosidáza F2 | ND |
| Endoglykosidáza F3 | ND |
| Endoglykosidáza H | ND |
| Proteáza | ND |
Vlastnosti
| EC číslo | 3.5.1.52(Rekombinant z mikroorganismu) |
| Molekulární váha | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrický bod | 8. 14 |
| Optimální pH | 7,0-8,0 |
| Optimální teplota | 65 °C |
| Specifičnost substrátu | Štěpení glykosidických vazeb mezi GlcNAc a asparaginovými zbytky Obr.1 |
| Rozpoznávací stránky | N-vázané glykany, pokud neobsahují a1-3 fukózu Obr |
| Aktivátory | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Skladovací teplota | -25 ~-15 ℃ |
| Tepelná inaktivace | 20 ul reakční směsi obsahující 1 ul PNGázy F se inaktivuje inkubací při 75 °C po dobu 10 minut. |
Obr. 1 Substrátová specificita PNGázy F
Obr. 2 Rozpoznávání PNGázy F.
Když jsou vnitřní zbytky GlcNAc spojeny s al-3 fukózou, PNGáza F nemůže štěpit N-vázané oligosacharidy z glykoproteinů.Tato modifikace je běžná u rostlin a některých hmyzích glykoproteinů.
Csoučásti
|
| Komponenty | Koncentrace |
| 1 | PNGase F | 50 ul |
| 2 | 10× Glykoprotein denaturační pufr | 1000 ul |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 ul |
| 4 | 10 % NP-40 | 1000 ul |
Definice jednotky
Jedna jednotka (U) je definována jako množství enzymu potřebného k odstranění >95 % sacharidu z 10 ug denaturované RNázy B za 1 hodinu při 37 °C v celkovém reakčním objemu 10 ul.
Reakční podmínky
1. Rozpusťte 1-20 µg glykoproteinu v deionizované vodě, přidejte 1 µl 10× Glycoprotein Denaturing Buffer a H2O (je-li to nutné), abyste získali celkový reakční objem 10 µl.
2.Inkubujte při 100 °C po dobu 10 minut, ochlaďte na ledu.
3.Přidejte 2 ul 10xGlycoBuffer 2, 2 ul 10% NP-40 a promíchejte.
4.Přidejte 1-2 µl PNGázy F a H2O (je-li to nutné) pro vytvoření celkového reakčního objemu 20 µl a promíchejte.
5.Reakce se inkubuje při 37 °C po dobu 60 minut.
6.Pro analýzu SDS-PAGE nebo HPLC analýzu.
