Enzym pro uzavírání virů vakcínie

Capping enzym viru vakcínie je odvozen z rekombinantního kmene E. coli, který nese geny pro capping enzym Vaccinia.Tento jediný enzym se skládá ze dvou podjednotek (D1 a D12) a má tři enzymatické aktivity (RNA trifosfatáza a guanylyltransferáza u podjednotky D1 a guanin methyltransferáza u podjednotky D12).Capping Enzyme viru vakcínie je účinný při katalýze tvorby čepicové struktury, která může specificky připojit strukturu čepičky 7-methylguanylátu (m7Gppp, Cap 0) na 5' konec RNA.Cap struktura (Cap 0) hraje důležitou roli při stabilizaci, transportu a translaci mRNA u eukaryot.Capping RNA enzymatickou reakcí je účinná a jednoduchá metoda, která může významně zlepšit stabilitu a translaci RNA pro in vitro transkripci, transfekci a mikroinjekci.

Komponenty

Enzym pro uzavírání virů vakcínie (10 U/μl)

10×Uzavírací vyrovnávací paměť

Podmínky skladování

-25～- 15℃ pro skladování （Vyhněte se opakovaným cyklům zmrazování a rozmrazování）

Vyrovnávací paměť úložiště

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Definice jednotky

Jedna jednotka zakončovacího enzymu viru vakcínie je definována jako množství enzymu potřebného k začlenění 10 pmol GTP do 80nt transkriptu za 1 hodinu při 37 °C.

Kontrola kvality

Exonukleáza:10 U Capping Enzymu viru vakcínie s 1 μg λ-Hind III štěpené DNA při 37 °C po dobu 16 hodin nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

Endonukleáza:10 U Capping Enzymu viru vakcínie s 1 μg λDNA při 37 °C po dobu 16 hodin nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

nickase:10 U Capping Enzymu viru vakcínie s 1 μg pBR322 při 37 °C po dobu 16 hodin nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

RNáza:10 U Capping Enzyme viru vakcínie s 1,6 μg MS2 RNA po dobu 4 hodin při 37 °C nevede k žádné degradaci, jak bylo stanoveno elektroforézou na agarózovém gelu.

1.coli DNA:10U viru Vaccinia Capping Enzyme se testuje na přítomnost genomové DNA E. coli pomocí TaqMan qPCR s primery specifickými pro lokus rRNA E. coli 16S.Kontaminace genomové DNA E. coli je ≤ 1 genom E. coli.

2.Bakteriální endotoxin: LAL-test, podle Chinese Pharmacopoeia IV 2020 edition, gelová limitní testovací metoda, obecné pravidlo (1143).Obsah bakteriálního endotoxinu by měl být ≤ 10 EU/mg.

Reakční systém a podmínky

1. Capping Protocol (reakční objem: 20 μL)

Tento postup je použitelný pro capping reakci 10μg RNA (≥100 nt) a může být zvětšen podle experimentálních požadavků.

I) Smíchejte 10 μg RNA a H2O bez nukleázy v 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce do konečného objemu 15,0 μl.*10 x uzavírací pufr: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 °C, pH 8,0)

2) Zahřívejte na 65 °C po dobu 5 minut a poté na ledovou lázeň po dobu 5 minut.

3) Přidejte následující součásti v uvedeném pořadí

*10 x uzavírací pufr: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 °C, pH 8,0)

4) Inkubujte při 37 °C po dobu 30 minut, RNA je nyní uzavřena a připravena pro následné aplikace.

2. 5′ koncovka značení reakce (objem reakce: 20 μL)

Tento protokol je navržen pro značení RNA obsahující 5´ trifosfát a lze jej škálovat podle požadavků.Účinnost začlenění značky bude ovlivněna molárním poměrem RNA:GTP, stejně jako obsahem GTP ve vzorcích RNA.

1) Smíchejte příslušné množství RNA a H2O bez nukleázy v 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce do konečného objemu 14,0 µl.

2) Zahřívejte na 65 °C po dobu 5 minut a poté na ledovou lázeň po dobu 5 minut.

3) Přidejte následující součásti v uvedeném pořadí.

** GTP MIX označuje GTP a malý počet markerů.Pro koncentraci GTP vizk poznámce 3.

4) Inkubujte při 37 °C po dobu 30 minut, 5′ konec RNA je nyní označen a připraven pro downstream

Aplikace

1. Uzavření mRNA před translačními testy/in vitro translací

2. Označení 5' konce mRNA

Poznámky k použití

1.Zahřátím roztoku RNA před inkubací s Vaccinia Capping Enzyme se odstraní sekundární struktura na 5´konci transkriptu.Prodlužte čas na 60 minut u přepisů se známými vysoce strukturovanými 5´koncemi.

2. RNA použitá pro překrytí reakce by měla být před použitím purifikována a suspendována ve vodě bez nukleázy.EDTA by neměla být přítomna a roztok by neměl obsahovat soli.

3. Pro značení 5' konce by celková koncentrace GTP měla být přibližně 1-3násobek molární koncentrace mRNA v reakci.

4. Objem reakčního systému lze zvětšit nebo snížit podle skutečného stavu.