5× Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kat. číslo: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) je vysoce stabilní směs na bázi sondy v jedné zkumavce vhodná pro jednokrokovou reverzní transkripci a kvantitativní PCR (qRT-PCR).Podporuje předmísení primerů a sond a zůstává stabilní po dlouhém skladování při nízké teplotě.Vzorek, který má být testován, lze přidat přímo při použití, bez dalšího otevírání zkumavky/pipetování.Tento produkt obsahuje komponenty, např. hot-start DNA polymerázu, M-MLV, tepelně labilní uracil DNA glykosylázu (TS-UNG), inhibitor RNázy, MgCl2dNTP (s dUTP místo dTTP) a stabilizátory.S geneticky modifikovanou rychlou amplifikační reverzní transkriptázou a DNA polymerázou je možné dokončit PCR amplifikaci během 20-40 minut.Toto činidlo používá speciální pufr pro qPCR se smíšenými enzymy anti-inhibičního amplifikačního enzymu a enzymu UNG.Proto může získat dobrou amplifikaci cílových genů a zabránit falešné amplifikaci způsobené reziduálním a aerosolovým znečištěním PCR.Toto činidlo je kompatibilní s většinou fluorescenčních kvantitativních PCR přístrojů od výrobců, jako jsou Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad a Roche.
Komponent
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5× Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Podmínky skladování
Všechny součásti by měly být uchovávány při -20 °C pro dlouhodobé skladování a 4 °C po dobu až 3 měsíců.Po rozmrazení důkladně promíchejte a před použitím odstřeďte.Vyhněte se častému zmrazování a rozmrazování.
Příprava reakčního systému qRT-PCR
| Komponenty | 25μLSystém | 50μLSystém | Závěrečné soustředění |
| 5× Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μl | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2 μl | 1× |
| 25× Směs primer-probea | 1μL | 2 μl | 1× |
| Template RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Až 25 μl | Až 50 μl | – |
1) a. Konečná koncentrace primeru je obvykle 0,2 μM.Pro lepší výsledky může být koncentrace primeru optimalizována v rozsahu 0,2-1μM.Obecně lze koncentraci sondy optimalizovat v rozsahu 0,1-0,3 μM.
2) b. Při použití rychlého postupu PCR může zvýšení koncentrace primerů a sond vést k lepším výsledkům amplifikace a jejich poměr by měl být odpovídajícím způsobem optimalizován.
3) Různé typy vzorků obsahují různé typy a obsah inhibitoru a počet kopií cílového genu.Objem vzorku by měl být posuzován podle skutečného stavu.Proveďte ředění vzorku vodou bez nukleázy nebo TE pufrem, je-li to nutné.
Reakce Cpodmínky
| Pravidelný postup PCR | Rychlý postup PCR | ||||||
| Postup | Temp. | Čas | Cyklus | Postup | Temp. | Čas | Cyklus |
| Reverzní transkripce | 50℃ | 10-20 min | 1 | Reverzní transkripce | 50℃ | 5 minut | 1 |
| Polymeráza Aktivace | 95℃ | 1-5 min | 1 | Polymeráza Aktivace | 95℃ | 30. léta | 1 |
| Denaturace | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturace | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Žíhání a Rozšíření | 56-64 ℃ | 20-60s | Žíhání a Rozšíření | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kontrola kvality
1.Detekce funkcí: citlivost, specificita a opakovatelnost qPCR.
2.Žádná exogenní nukleázová aktivita: žádné znečištění exogenní endonukleázou a exonukleázou.
Poznámky
1.Rychlost amplifikace rychlé DNA polymerázy není menší než 1 kb/10 s.Různé PCR přístroje mají různé rychlosti ohřevu a chlazení, režimy regulace teploty a tepelnou vodivost, a proto je nezbytná optimalizace koncentrace vašeho primeru/sondy a způsobu běhu v kombinaci s vaším specifickým nástrojem pro rychlou PCR.
2.Tento produkt má širokou použitelnost a je vhodný pro vysoce citlivou molekulární diagnostiku.Tříkroková PCR metoda se doporučuje pro primery s nízkou teplotou nasedání nebo pro amplifikaci dlouhých fragmentů nad 200 bp.
3.Vzhledem k tomu, že různé amplikony mají různou účinnost využití dUTP a různou citlivost na UNG, měla by být činidla optimalizována, pokud se citlivost detekce sníží při použití systému UNG.V případě potřeby nás prosím kontaktujte pro technickou podporu.
4.Aby se zabránilo amplifikaci přenášených produktů PCR, je pro amplifikaci vyžadována vyhrazená experimentální oblast a pipeta.Pracujte v rukavicích a často měňte a neotevírejte zkumavku PCR po amplifikaci.
