Mini sada pro extrakci DNA
Tato souprava využívá optimalizovaný systém pufrů a technologii čištění kolon silikagelu, které mohou získat fragmenty DNA o velikosti 70 bp – 20 kb z různých koncentrací agarózového gelu TAE nebo TBE.DNA adsorpční kolona může speciálně adsorbovat DNA za podmínek s vysokým obsahem soli.Kromě toho může souprava přímo purifikovat fragmenty DNA z produktů PCR, enzymatických reakčních systémů nebo surových produktů DNA získaných jinými metodami a odstranit nečistoty, jako jsou proteiny, jiné organické sloučeniny, ionty anorganických solí a oligonukleotidové primery.Může zajistit, že čištění může být dokončeno během 10-15 minut.Purifikovaná DNA může být použita přímo pro ligaci, transformaci, enzymové štěpení, in vitro transkripci, PCR, sekvenování, mikroinjekce atd.
Podmínky skladování
Skladujte při -15 ~ -25 ℃ a přepravujte při pokojové teplotě.
Komponenty
| Komponenty | (100 rxns) |
| Vyrovnávací HDP | 80 ml |
| Vyrovnávací paměť GW | 2 × 20 ml |
| Eluční pufr | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Vyrovnávací HDP:DNA vazebný pufr.
Vyrovnávací paměť GW:Promývací pufr;před použitím přidejte absolutní etanol v množství uvedeném na lahvičce.
Eluční pufr:Eluce.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA adsorpční kolony.
Sběrné zkumavky 2 ml:Sběrné zkumavky na filtrát.
Připravené materiály
1,5 ml sterilizované zkumavky, absolutní ethanol a isopropanol (když fragment DNA ≤100 bp, přidejte 1 objem
isopropanol na 1 objem gelu), vodní lázeň.
Experimentální proces
Před použitím přidejte 80 ml ethanolu do zředěného pufru GW, jak je uvedeno na štítku, skladujte při pokojové teplotě.
Mechanismus
1. PCR reakční roztok
Schéma gelové extrakce: Přidejte stejný objem Schéma obnovení reakčního roztoku pufru GDP:Přidejte 5násobek objemu pufru
2. HDP Vypočítejte objem gelu (100 μl se rovná 100 mg)
Rozpusťte gel
3. Předehřejte na 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Přidejte 300 μl pufru GDP*
Přidejte 700 μl pufru GW
Přidejte 700 μl pufru GW
5. Eluovat
Přidejte 20 – 30 μl elučního pufru nebo deionizované vody
Poznámky* Regenerace reakční tekutiny PCR bez tohoto kroku
Program extrakce gelu
1. Po elektroforéze DNA pro frakcionaci fragmentů DNA vyřízněte jeden proužek fragmentu DNA z agarózového gelu pod UV světlem.Doporučuje se použít savý papír k absorbování zdánlivé vlhkosti gelu a minimalizaci velikosti plátku gelu odstraněním přebytečné agarózy, jak je to jen možné.Zvažte gelový plátek (bez mikrocentrifugační zkumavky), abyste vypočítali jeho objem: Objem 100 mg gelového plátku je přibližně 100 μl, za předpokladu hustoty 1 g/ml.
2. Přidejte stejný objem pufru GDP, inkubujte při 50~55°C po dobu 7-10 minut (podle velikosti gelu upravte dobu inkubace, dokud se gel zcela nerozpustí).Během inkubace 2x obraťte zkumavku.
Δ Přidání 1-3 objemů Buffer GDP neovlivní účinnost obnovy DNA.Pokud fragment DNA, který má být získán, <100 bp, je třeba přidat 3 objemy pufru GDP;když se plátek gelu úplně rozpustí, přidejte 1 objem isopropanolu a důkladně promíchejte, poté pokračujte dalším krokem.
3. Krátce centrifugujte, aby se vzorek dostal na dno zkumavky, vložte FastPure DNA Mini Columns-G do odběrových zkumavek 2 ml, opatrně přeneste roztok maximálně 700 μl jednou za rok.
čas do filtračních kolon, centrifugujte při 12 000 ot./min (13 800 x g) po dobu 30-60 sekund.
4. Odstraňte filtrát a přidejte 300 μl pufru GDP do kolony, inkubujte při pokojové teplotě po dobu 1 minuty, odstřeďujte při 12 000 ot./min (13 800 x g) po dobu 30-60 sekund.
5. Filtrát zlikvidujte a přidejte 700 μl pufru GW (zkontrolujte, zda byl předem přidán absolutní etanol!) do kolony, centrifugujte při 12 000 ot./min (13 800 x g) po dobu 30-60 sekund.
Δ Přidejte Buffer GW kolem stěny adsorpční kolony nebo přidejte zadní kryt Buffer GW a 2–3krát promíchejte dnem vzhůru, aby se sůl ulpívající na stěně zkumavky úplně propláchla.
6. Opakujte krok 5.
Δ Dvojité propláchnutí pufrem GW může zajistit úplné odstranění soli a eliminovat dopad na následné experimenty.
7. Odstraňte filtrát a centrifugujte prázdnou kolonu při 12 000 ot./min (13 800 x g) po dobu 2 minut.
8. Vložte kolonu do čisté 1,5ml mikrocentrifugační zkumavky, přidejte 20 - 30 μl elučního pufru do středu membrány kolony, inkubujte 2 minuty a poté centrifugujte při 12 000 otáčkách za minutu (13 800 x g) po dobu 1 minuty.Kolonu zlikvidujte, získanou DNA skladujte při -20 °C.
Δ Přenesení supernatantu z kroku 8 do kolony k opětovné eluci a předehřátí elučního pufru na 55 (když fragment DNA > 3 kb) může pomoci zvýšit účinnost izolace.
Program obnovy produktů PCR
Tento protokol je použitelný pro purifikaci fragmentů DNA z produktů PCR, enzymatického reakčního systému a dalších hrubých produktů DNA (včetně genetické DNA).Tento roztok dokáže účinně odstranit různé nukleotidy, primery, dimery primerů, molekuly solí, enzymy a další nečistoty.
1. Krátce odstřeďte produkty PCR, roztok enzymatické reakce a další surové produkty DNA.Pomocí pipety odhadněte jejich objem a přeneste do sterilizované zkumavky o objemu 1,5 ml nebo 2 ml.Přidejte ddH2O do objemu 100 μl;zatímco u genomové DNA s vysokou koncentrací pomůže zředění na 300 μl ddH2O zlepšit účinnost regenerace.
2. Přidejte 5 objemů pufru GDP, důkladně promíchejte převracením nebo vortexováním.Pokud je požadovaný fragment DNA >100 bp, je třeba přidat dalších 1,5 objemu (vzorky + HDP pufru) ethanolu.
3. Vložte kolonu zpět do sběrné zkumavky, přeneste směs do kolony, centrifugujte při 12 000 ot./min (13 800 × g) po dobu 30 – 60 sekund.Pokud je objem smíchaného roztoku >700 µl, vložte adsorpční kolonu zpět do sběrné zkumavky, přeneste zbývající roztok do adsorpční kolony a centrifugujte při 12 000 ot./min (13 800 × g) po dobu 30 – 60 sekund.
4. Další provedení se vztahuje ke kroku 5 – 8 programu 08-1/Gelová extrakce.
Aplikace
Různé koncentrace TAE nebo TBE agarózového gelu;Produkty PCR, enzymatické reakční systémy nebo jiné surové produkty DNA získané různými metodami.Obnovené fragmenty se pohybovaly od70 bp - 20 kb.
Poznámky
Pouze pro výzkumné použití.Není určeno pro diagnostické postupy.
1. Před použitím přidejte 80 ml ethanolu do zředěného pufru GW, jak je uvedeno na štítku, skladujte při pokojové teplotě.
2. Pokud se Buffer GDP snadno vysráží během skladování při nízké teplotě, může být před použitím po určitou dobu umístěn při pokojové teplotě.V případě potřeby lze předehřát ve vodní lázni na 37 °C, dokud se sraženina zcela nerozpustí, a poté ji lze po smíchání použít.
3. Předem nastavte teplotu vodní lázně na 50 ~ 55℃.
4. V 08-1/Program extrakce gelu, krok 1, minimalizace velikosti gelového plátku výrazně zkrátí dobu rozpouštění a zvýší účinnost regenerace (linearizovaná DNA se snadno hydrolyzuje, když je neustále vystavena vysoké teplotě).Nevystavujte DNA gel UV záření po dlouhou dobu, protože ultrafialové světlo může způsobit poškození DNA.
5. Gel úplně rozpusťte v 08- 1/Program extrakce gelu krok 2, jinak bude vážně ovlivněna účinnost obnovy DNA.
6. Předehřejte eluční pufr nebo ddH2O na 55 °C, což je užitečné pro zlepšení účinnosti eluce DNA.DNA se doporučuje skladovat v eluentu 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
