EndoFree Plasmid Maxi Kit
Tato souprava je vhodná pro extrakci ze 150 – 300 ml bakteriálního roztoku kultivovaného přes noc za použití vylepšené metody SDS-alkalické lýzy k lýze bakterií.Surový extrakt je selektivně kombinován s unikátním Endotoxin Scavenger a separován centrifugací k odstranění endotoxinů.Poté se silikagelová membrána selektivně váže na plazmidovou DNA v roztoku za podmínek vysokého obsahu soli a nízkého pH.Následuje přidání promývacího pufru k odstranění nečistot a dalších bakteriálních složek.Nakonec se k eluci čisté plazmidové DNA z membrány křemíkové matrice použije eluční pufr s nízkým obsahem soli a vysokým pH.Silikagelová membrána využívá speciální adsorpční membránu a rozdíl adsorpčního množství mezi kolonou a kolonou je velmi malý a opakovatelnost je dobrá.Fenol, chloroform a další toxická činidla nejsou vyžadována, stejně jako kroky srážení ethanolem.Tento kit lze použít k rychlé extrakci 0,2 – 1,5 mg čisté plazmidové DNA s vysokým počtem kopií s rychlostí extrakce 80 % – 90 %.Souprava využívá unikátní procesní vzorec odstraňuje endotoxin, obsah endotoxinu je extrémně nízký a efekt buněčné transfekce je vynikající.Extrahovaný plazmid by mohl být přímo použit při enzymatické digesci, PCR, in vitro transkripci, transformaci, sekvenování a dalších experimentech molekulární biologie.
Podmínky skladování
RNaseA by měla být skladována při -30 ~ -15 ℃ a přepravována při ≤ 0 ℃.
Endotoxin Scavenger může být skladován při 2 ~ 8 ℃ po dobu jednoho měsíce, skladován při -30 ~ -15 ℃ pro dlouhodobé skladovánía přepravovány při ≤0℃.
Ostatní komponenty by měly být skladovány při pokojové teplotě (15 ~25℃) a přepravovány při pokojové teplotě.
Komponenty
| Komponenty | 10RXNS |
| RNáza A | 750 μl |
| Vyrovnávací paměť P1 | 75 ml |
| Vyrovnávací paměť P2 | 75 ml |
| Vyrovnávací paměť P4 | 75 ml |
| Scavenger endotoxinů | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi Columns (každá v 50ml sběrné zkumavce) | 10 |
| Sběrná zkumavka bez endotoxinů | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, používá se k odstranění RNA.
Vyrovnávací paměť P1:bakteriální suspenzní pufr, před prvním použitím přidejte RNasuA do pufru P1.
Vyrovnávací paměť P2:bakteriální lyzační pufr (obsahující SDS/NaOH).
Vyrovnávací paměť P4:neutralizační pufr.
Vychytávač endotoxinů:účinně odstraní endotoxin ze surového plasmidového extraktu.
Buffer PW:promývacího pufru, před prvním použitím přidejte stanovený objem etanolu.
Vyrovnávací paměť TB:elučního pufru.
Maxi kolony FastPure DNA:adsorpční kolony plasmidové DNA.
Sběrné zkumavky 50 ml:sběrné zkumavky filtrátu.
Sběrná zkumavka bez endotoxinů:odběrové zkumavky plasmidové DNA.
Připravené materiály
Absolutní etanol, isopropanol, 50 ml centrifugační zkumavky s kulatým dnem a 50 ml bez endotoxinůcentrifugační zkumavky.
Aplikace
Tento produkt je vhodný pro extrakci plazmidů ve velkém měřítku ze 150 - 300 ml bakteriálního roztokukultivován přes noc.
Experimentální proces
1. Vezměte 150 – 200 ml (ne více než 300 ml) bakteriálního roztoku kultivovaného přes noc a odstřeďte přiasi 11 000 ot./min (12 000 × g) po dobu 1 – 2 min.Odstraňte supernatant a seberte bakterie.
Δ Při odběru více než 50 ml bakteriálního roztoku lze bakterie odebrat přidáním bakteriálního roztoku, odstředěním, odstraněním supernatantu a dalšími kroky ve stejné zkumavce o objemu 50 ml.
vícekrát.
2. Přidejte 7,5 ml pufru P1 (zkontrolujte, zda byla do pufru P1 přidána RNázaA) do centrifugyzkumavku obsahující bakterie a důkladně promíchejte na vortexu nebo pipetování.
Δ Úplná resuspenze bakterií v tomto kroku je rozhodující pro výtěžek a po resuspendování by neměly být žádné shluky bakterií.Pokud existují bakteriální shluky, které nejsou důkladně promíchány, ovlivní to lýzu, což má za následek nízký výtěžek a čistotu.Pokud je OD600 bakteriálního roztoku 0,65, doporučuje se při extrakci ze 150 ml bakteriálního roztoku použít 7,5 ml pufru P1;když je OD600 0,75, mělo by se použít 8 ml pufru P1 a objemy pufrů P2 a P4 by se měly odpovídajícím způsobem změnit.Pokud se objem bakteriálního roztoku zvýší na 200 ml, doporučuje seobjem pufrů P1, P2 a P4 se proporcionálně zvyšuje.
3. Přidejte 7,5 ml pufru P2 k bakteriální suspenzi z kroku 2 a jemně promíchejte nahoru a dolů po dobu 6 – 8krát a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 4 – 5 minut.
Δ Jemně obraťte, aby se směs důkladně promíchala.Vortexování způsobí fragmentaci genomové DNA, což má za následek fragmenty genomové DNA v extrahovaném plazmidu.V tomto okamžiku se roztok stává viskózním a průsvitným, což ukazuje, že bakterie byly plně lyžovány.Doba trvání by neměla přesáhnout 5 minut, aby se zabránilo destrukci plazmidů.Pokud roztok není čirý, může být výsledkem příliš mnoho bakteriíneúplná lýza, takže množství bakterií by mělo být přiměřeně sníženo.
4. Přidejte 7,5 ml pufru P4 k bakteriální suspenzi z kroku 3 a ihned opatrně 6–8krát převraťte, aby roztok zcela zneutralizoval pufr P2.V tomto okamžiku by se měla objevit bílá vločkovitá sraženina.Centrifugujte při více než 11 000 otáčkách za minutu (12 000 × g) po dobu 10 – 15 minut, opatrně napipetujte supernatant do nové 50ml centrifugační zkumavky s kulatým dnem (samopřipravené) a vyhněte seaspirujte plovoucí bílou sraženinu.
Δ Přidejte pufr P4 a ihned obraťte, aby se dobře promíchal.Nechte zkumavku stát, dokud se bílá sraženina rovnoměrně nerozdělí v roztoku, aby se zabránilo tvorbě lokálních sraženin, které by mohly ovlivnit neutralizaci.Pokud před centrifugací není žádná stejnoměrná bílá vločkovitá sraženina a supernatant není po centrifugaci čirý, lze zkumavkucentrifugováno dalších 5 min.
5. Přidejte 0,1 násobek objemu (10 % objemu supernatantu, asi 2,2 ml) Endotoxin Scavenger k supernatantu z kroku 4 a převraťte, aby se promíchalo.Umístěte roztok do ledové lázně nebo vložte do drceného ledu (nebo lednice s mrazákem) na 5 minut, dokud se roztok nezmění ze zakaleného na čirý a průhledný (nebo stálemírně zakalené) a občas několikrát promíchejte.
Δ Po přidání lapače endotoxinů do supernatantu se supernatant zakalí, alesupernatant by se měl po ochlazení v ledové lázni vyjasnit (nebo mírně zakalit).
6. Poté, co je supernatant umístěn při pokojové teplotě (>25 °C) na 10 – 15 minut, zakalí se jakojeho teplota vzroste na pokojovou teplotu.Poté by měl být supernatant převrácen, aby se promíchal.
Δ Pokud je pokojová teplota nižší nebo chcete zkrátit dobu extrakce, může být supernatant inkubován ve vodní lázni o teplotě 37 ~ 42 ℃ po dobu 5 – 10 minut a další krok může být proveden po supernatantuse zakalí.
7. Centrifugujte supernatant při přibližně 11 000 otáčkách za minutu (12 000 × g) po dobu 10 minut při pokojové teplotě (teplota musí být >25 °C), aby se fáze oddělila.Horní vodná fáze obsahuje DNA, zatímco spodní modrá vrstva olejové fáze obsahuje endotoxin a další nečistoty.PřenesteVodná fáze obsahující DNA do nové zkumavky aodstraňte olejovou vrstvu.
Δ Teplota během odstřeďování musí být vyšší než 25 °C, protože efektivní separace fází tomu tak nenídojde, pokud je teplota příliš nízká.
Δ Pokud separace fází není účinná, lze teplotu odstřeďování upravit na 30 °C adobu odstřeďování lze prodloužit na 15 min.
Δ Nevysávejte modrou mastnou vrstvu, protože obsahuje endotoxin a další nečistoty.
Mechanismus
Resuspenzní neutralizace lýzy
◇ Přidejte 7,5 ml pufru P1
◇ Přidejte 7,5 ml pufru P2
◇ Přidejte 7,5 ml pufru P4
Odstranění endotoxinu
◇Přidejte 0,1násobek objemu supernatantu Endotoxin Scavenger
Vázání a praní
◇ Přidejte 0,5násobek objemu isopropanolu
◇ Přidejte 10 ml pufru PW
◇ Přidejte 10 ml pufru PW
Eluce
◇ Přidejte 1 – 2 ml pufru TB nebo ddH2O bez endotoxinu
