M-MLV Neoscript reverzní transkriptáza
Reverzní transkriptáza Neoscript je reverzní transkriptáza získaná mutačním screeningem genu M-MLV původu a exprese viru myší leukémie Moloney v E. coli.Enzym odstraňuje aktivitu RNázy H, má vyšší teplotní toleranci a je vhodný pro vysokoteplotní reverzní transkripci.Proto je užitečný pro eliminaci nepříznivých vlivů vysokoúrovňové struktury RNA a nespecifických faktorů na syntézu cDNA a má vyšší stabilitu a schopnost syntézy reverzní transkripce.Enzym má vyšší stabilitu a schopnost syntézy reverzní transkripce.
Komponenty
1.200 U/μL Neoscript reverzní transkriptáza
2.5 × vyrovnávací paměť prvního vlákna (volitelné)
* 5 × First-Strand Buffer neobsahuje dNTP, přidejte dNTP při přípravě reakčního systému
Doporučená aplikace
1.Jednokroková qRT-PCR.
2.Detekce RNA viru.
Skladovací stav
-20°C pro dlouhodobé skladování, před použitím je třeba dobře promíchat, vyhnout se častému zmrazování a rozmrazování.
Definice jednotky
Jedna jednotka obsahuje 1 nmol dTTP za 10 minut při 37 °C pomocí poly(A)•oligo(dT)25jako šablona/primer.
Kontrola kvality
1.Elektroforetická čistota SDS-PAGE vyšší než 98 %.
2.Citlivost zesílení, kontrola mezi dávkami, stabilita.
3.Žádná exogenní nukleázová aktivita, žádná exogenní endonukleáza nebo kontaminace exonukleázou
Nastavení reakce pro řešení první řetězové reakce
1.Příprava reakční směsi
| Komponenty | Hlasitost |
| oligo (dT)12-18 Základní nátěr nebo Random PrimerA Nebo Gene Specific Primeryb | 50 pmol |
| 50 pmol (20–100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Template RNA | Celková RNA ≤ 5 μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH bez RNázy2O | Do 10 μl |
Poznámky:a/b: Vyberte prosím různé typy primerů podle vašich experimentálních potřeb.
2.Zahřívejte na 65 °C po dobu 5 minut a rychle ochlaďte na ledu po dobu 2 minut.
3.Přidejte následující složky do výše uvedeného systému do celkového objemu 20 µl a jemně promíchejte:
| Komponenty | Hlasitost (μL) |
| 5 × vyrovnávací paměť prvního vlákna | 4 |
| Neoscript reverzní transkriptáza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNázy (40 U/μL) | 1 |
| dH bez RNázy2O | Do 20 μl |
4.Proveďte prosím reakci podle následujících podmínek:
(1) Pokud je použit Random Primer, reakce by měla být provedena při 25 °C po dobu 10 minut a poté při 50 °C po dobu 30~60 minut;
(2) Pokud se použije Oligo dT nebo specifické primery, reakce by měla být provedena při 50 °C po dobu 30~60 minut.
5.Zahřívejte na 95 °C po dobu 5 minut, abyste inaktivovali Neoscript reverzní transkriptázu a ukončili reakci.
6.Produkty reverzní transkripce mohou být použity přímo v PCR reakci a fluorescenční kvantitativní PCR reakci, nebo mohou být skladovány při -20 °C po dlouhou dobu.
PCR Rakce:
1.Příprava reakční směsi
| Komponenty | Koncentrace |
| 10 × PCR pufr (bez dNTP, bez Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM každý dNTP) | 200 uM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA polymeráza (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 uM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 uM |
| ŠablonaA | ≤10 % roztok pro první řetězovou reakci (2 μl) |
| ddH2O | Do 50 μl |
Poznámky:a: Pokud se přidá příliš mnoho roztoku první řetězové reakce, může být reakce PCR inhibována.
2.Postup PCR reakce
| Krok | Teplota | Čas | Cykly |
| Předdenaturace | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturace | 95℃ | 10-20 sec | 30-40 |
| Žíhání | 50-60 ℃ | 10-30 sec | |
| Rozšíření | 72 ℃ | 10-60 sec |
Poznámky
1.Vhodné pro optimalizaci teploty reverzní transkripce v rozsahu 42℃~55℃.
2.Má lepší stabilitu, je vhodný pro vysokoteplotní reverzní transkripční amplifikaci.Kromě toho je výhodný pro účinný průchod komplexními strukturními oblastmi RNA.Také toje vhodný pro jednokrokovou multiplexní fluorescenční kvantitativní detekci RT-PCR.
3.Dobrá kompatibilita s různými PCR amplifikačními enzymy a je vhodný pro vysoce citlivé RT-PCR reakce.
4.Vhodné pro vysoce citlivou jednokrokovou fluorescenční kvantitativní RT-PCR reakci, účinně zlepšuje rychlost detekce nízké koncentrace templátů.
5.Vhodné pro konstrukci knihovny cDNA.
