Proteináza K NGS (prášek)
Kat. číslo: HC4507A
NGS Proteáza K je stabilní serinová proteáza s vysokou enzymatickou aktivitou a širokou substrátovou specifitou. Enzym přednostně rozkládá esterové vazby a peptidové vazby sousedící s C-koncem hydrofobních aminokyselin, aminokyselin obsahujících síru a aromatických aminokyselin.Často se tedy používá k degradaci proteinů na krátké peptidy.NGS Proteáza K je typická serinová proteáza s Asp39-Jeho69-Ser224katalytická triáda, která je jedinečná pro serinové proteázy, a katalytické centrum je obklopeno koudelem Ca2+vazebná místa pro stabilizaci, udržení vysoké enzymatické aktivity v širším rozsahu podmínek.
Specifikace
| Vzhled | Bílý až téměř bílý amorfní prášek, lyofilizovaný |
| Specifická činnost | ≥40U/mg pevné látky |
| DNase | Nebyla zjištěna žádná |
| RNáza | Nebyla zjištěna žádná |
| Biozátěž | < 50 CFU/g pevné látky |
| Zbytek nukleové kyseliny | <5 pg/mg pevné látky |
Vlastnosti
| Zdroj | Album Tritirachium |
| EC číslo | 3.4.21.64(Rekombinant z alba Tritirachium) |
| Molekulární váha | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrický bod | 7,81 Obr.1 |
| Optimální pH | 7,0-12,0 (Všechny vykonávají vysokou aktivitu) Obr.2 |
| Optimální teplota | 65℃ Obr.3 |
| Stabilita pH | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) Obr.4 |
| Tepelná stabilita | Pod 50℃ (pH 8,0, 30 min) Obr.5 |
| Stabilita při skladování | Skladováno při 25℃ po dobu 12 měsíců Obr.6 |
| Aktivátory | SDS, močovina |
| Inhibitory | diisopropylfluorfosfát;benzylsulfonylfluorid |
Podmínky skladování
Skladujte lyofilizovaný prášek při -25~-15 ℃ po dlouhou dobu mimo světlo;Po rozpuštění alikvot do vhodného objemu pro krátkodobé skladování při 2-8 °C mimo světlo nebo dlouhodobé skladování při -25~-15 °C mimo světlo.
Opatření
Při používání nebo vážení používejte ochranné rukavice a brýle a po použití dobře větrejte.Tento produkt může způsobit kožní alergickou reakci a vážné podráždění očí.Při vdechnutí může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dušnost.Může způsobit podráždění dýchacích cest.
Definice jednotky
Jedna jednotka NGS Proteázy K je definována jako množství enzymu potřebného k hydrolýze kaseinu na 1 μmol L-tyrosinu za standardních podmínek stanovení.
Příprava činidel
| Činidlo | Výrobce | Katalog |
| Technický kaseinz hovězího mléka | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HP04 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Kyselina trichloroctová | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Octan sodný | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Octová kyselina | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Uhličitan sodný | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| folin-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosin | Sigma | 93829 |
Činidlo I:
Substrát: 1% kasein z roztoku hovězího mléka: rozpusťte 1 g kaseinu z hovězího mléka v 50 ml 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného, pH 8,0, zahřívejte ve vodní lázni na 65-70 °C po dobu 15 minut, zamíchejte a rozpusťte, ochlaďte vodou, upravte hydroxid sodný na pH 8,0 a zředí se na 100 ml.
Činidlo II:
Roztok TCA: 0,1 M kyselina trichloroctová, 0,2 M octan sodný a 0,3 M kyselina octová (navažte postupně 1,64 g kyseliny trichloroctové + 1,64 g octanu sodného + 1,724 ml kyseliny octové, přidejte 50 ml deionizované vody, upravte pomocí HCl na pH 4,03 a zřeďte 100 ml).
Činidlo III:
0,4 m roztok uhličitanu sodného (navažte 4,24 g bezvodého uhličitanu sodného a rozpusťte ve 100 ml vody)
Činidlo IV:
Folin fenolové činidlo: zřeďte 5krát deionizovanou vodou.
Činidlo V:
Enzymové ředidlo: 0,1 M roztok fosforečnanu sodného, pH 8,0.
Činidlo VI:
Standardní roztok L-tyrosinu: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosinu rozpuštěného s 0,2M HC1.
Postup
1. Zapněte UV-Vis spektrofotometr a zvolte fotometrické měření.
2. Nastavte vlnovou délku na 660nm.
3. Zapněte vodní lázeň, nastavte teplotu na 37℃, zajistěte nezměněnou teplotu po dobu 3-5 minut.
4. Předehřejte 0,5 ml substrátu v 2 ml centrifugační zkumavce při 37 °C vodní lázni po dobu 10 minut.
5. Extrahujte 0,5 ml zředěného roztoku enzymu do předehřáté centrifugační zkumavky po dobu 10 minut.Nastavte enzymové ředidlo jako prázdnou skupinu.
6. Ihned po reakci přidejte 1,0 ml činidla TCA.Dobře promíchejte a inkubujte ve vodní lázni po dobu 30 minut.
7. Centrifugujte reakční roztok.
8. Přidejte následující součásti v uvedeném pořadí.
| Činidlo | Hlasitost |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4M uhličitan sodný | 2,5 ml |
| Folin fenolové činidlo | 0,5 ml |
9. Před inkubací ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 30 minut dobře promíchejte.
10. OD660byla stanovena jako OD1;slepá kontrolní skupina: Enzymové ředidlo se používá k nahrazení roztoku enzymu ke stanovení OD660jako OD2, AOD=OD1-OD2.
11. Standardní křivka L-tyrosinu: 0,5 ml různé koncentrace roztoku L-tyrosinu, 2,5 ml 0,4 M uhličitanu sodného, 0,5 ml Folin fenolového činidla v 5 ml centrifugační zkumavce, inkubovat při 37 °C po dobu 30 minut, detekovat OD660pro různé koncentrace L-tyrosinu, pak se získala standardní křivka Y=kX+b, kde Y je koncentrace L-tyrosinu, X je OD600.
Výpočet
2: Celkový objem reakčního roztoku (ml)
0,5: Objem roztoku enzymu (ml)
0,5: Objem reakční kapaliny použitý při chromogenním stanovení (ml)
10: Reakční doba (min)
Df: Vícenásobné ředění
C: Koncentrace enzymu (mg/ml)
Postavy
Obr.1 Zbytek DNA
| Vzorek | Ave C4 | Nukleová kyselina Obnova (pg/mg) | Zotavení(%) | Total Nucleic Kyselina ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83 % | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12,955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19,125 | |||
| STD4 | 23,135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| H2O bez RNA | Neurčeno | — | — | — |
Obr.2 Optimální pH
Obr.3 Optimální teplota
Obr.4 Stabilita pH
Obr.5 Tepelná stabilita
Obr.6 Stabilita při skladování při 25℃
