2× Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kat. číslo: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) je určen k provádění PCR přímo ze vzorků bez extrakce DNA nebo přípravy vzorku.Toto činidlo se skládá z hot-start DNA polymerázy, uracil DNA glykosylázy (UNG), inhibitoru RNázy, MgCl2dNTP (s dUTP místo dTTP) a stabilizátory pro kvantitativní PCR (qPCR).Toto činidlo vytváří vysokou toleranci inhibitoru, a proto jej lze přímo použít k detekci vzorků, jako jsou výtěry z krku, sliny, antikoagulovaná plná krev, plazma a sérum bez extrakce DNA.Činidlo používá proprietární pufr pro qPCR se smíšenými enzymy anti-inhibiční DNA polymerázy a UNG enzymu.Proto může získat dobrou amplifikaci cílových genů ve vzorcích obsahujících inhibitory a inhibovat falešně pozitivní amplifikaci způsobenou reziduálním PCR a znečištěním aerosolem.Toto činidlo je kompatibilní s většinou fluorescenčních kvantitativních PCR přístrojů, jako jsou Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche a tak dále.
Komponenty
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2× SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Podmínky skladování
Všechny součásti by měly být uchovávány při -20 °C pro dlouhodobé skladování a 4 °C po dobu až 3 měsíců.Po rozmrazení důkladně promíchejte a před použitím odstřeďte.Vyhněte se častému zmrazování a rozmrazování.
Cyklistický protokol
| Krok | Teplota | Čas | Cyklus |
| Trávení | 50℃ | 2 min | 1 |
| Aktivace polymerázy | 95℃ | 1-5min | 1 |
| Denaturace | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Žíhání/prodlužování | 56-64 ℃ | 20-60s |
Pokyny pro pipetování
| Činidlo | Objem za reakce | Objem na reakci | Závěrečné soustředění |
| 2× SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 ul | 25 ul | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 ul | 1 ul | 1× |
| 25× Směs primer-probe1, 2 | 1 ul | 2 ul | 1× |
| Vzorek3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Celkový objem | 25 μl | 50 μL | - |
1. Konečná koncentrace primeru je obvykle 0,2 μM.Pro lepší výsledky může být koncentrace primeru optimalizována v rozsahu 0,2-1μM.
2. Obecně lze koncentraci sondy optimalizovat v rozsahu 0,1-0,3μM.Optimální koncentrace sondy souvisí s přístrojem pro amplifikaci PCR v reálném čase, typem sondy a typem fluorescenčně značící látky.Prostudujte si prosím manuál k přístroji nebo specifické požadavky každé fluorescenční sondy.
3. Různé typy vzorků obsahují různé typy a obsah inhibitoru a počet kopií cílového genu.Objem vzorku by měl být posuzován podle skutečného stavu.Proveďte ředění vzorku přidáním vody bez nukleázy nebo TE pufru, je-li to nutné.
4. Doporučený objem různých vzorků:
| Vzorek | Objem za jednu 50 μL reakce | Maximum poměr |
| Antikoagulovaná plná krev | 2,5 μl | 5% |
| Plazma | 15 μl | 30 % |
| Sérum | 10 μL | 20 % |
| Výtěr z krku | 10 μL | 20 % |
| Sliny | 10 μL | 20 % |
Kontrola kvality
1. Detekce funkce: senzitivita, specificita a opakovatelnost qPCR.
2. Žádná exogenní nukleázová aktivita: žádné znečištění exogenní endonukleázou a exonukleázou.
Poznámky k produktu
1. Tento produkt využívá nový typ hot-start DNA polymerázy, kterou lze aktivovat za 1-5 minut. Protože jeho reakční pufr byl optimalizován, je vhodnější pro dvojitou nebo vícenásobnou fluorescenční kvantitativní PCR s použitím sondové metody.
2. Pokud je hodnota Rn PCR amplifikace příliš nízká nebo je amplifikace zjevně inhibována, může snížení množství vzorku, zvýšení reakčního objemu nebo předchozí ředění vzorku zlepšit výsledky.
3. Odběr krve, slin, moči, výtěru z krku atd. by měl splňovat požadavky klinických kritérií a čerstvý vzorek lze použít k prevenci degradace nukleové kyseliny.
4. Vzhledem k tomu, že různé amplikony mají různou účinnost využití než dUTP a citlivost na UNG, měla by být činidla optimalizována, pokud se citlivost detekce sníží při použití systému UNG.V případě potřeby nás prosím kontaktujte pro technickou podporu.
5. Aby se zabránilo amplifikaci přenášených produktů PCR mezi jednokrokovými reakcemi, je pro amplifikaci vyžadována vyhrazená experimentální oblast a pipeta.Pracujte v rukavicích a často měňte a neotevírejte reakční zkumavku po amplifikaci PCR.
