Plant direct PCR Kit

Kat. číslo: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit je vhodný pro přímou amplifikaci rostlinných listů, semen atd. a lze jej použít pro vysoce výkonný screening rostlinných vzorků, které neobsahují polysacharidy a polyfenoly.Přímá amplifikace DNA polymerázy založená na řízené evoluci má vynikající toleranci k inhibitorům PCR v rostlinách.Mezitím si zachovává vysoký amplifikační výkon, který je vhodný pro amplifikaci fragmentů DNA do 5 kb.Jedinečný lyzační pufr A v soupravě lze použít k lýze čerstvých nebo zmrazených rostlinných tkání.Snadno se ovládá a lyzát lze použít jako templát pro amplifikaci bez čištění.Systém obsahuje ochranné látky, které umožňují efektivní amplifikaci surových vzorků po opakovaném zmrazování a rozmrazování.2 × Plant Direct Master Mix potřebuje pouze přidat primery a templáty k provedení amplifikační reakce, čímž se sníží pipetovací operace a zlepší se detekce a reprodukovatelnost výsledků.

Komponenty

*Plant Direct Lysis Buffer B je volitelné činidlo, které se používá k neutralizaci Plant Direct Lysis Buffer A pro prodloužení doby skladování vzorků.Může být použit podle skutečné situace.

Podmínky skladování

2 × Plant Direct Master Mix, skladujte při -30 ~ -15 ℃ a vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazování;Zasaďte přímý lyzační pufr, skladujte při -30 ~ -15 ℃ nebo 2 ~ 8 ℃.

Experimentální proces

Zpracování vzorku–List rostliny

Přímá metoda:Doporučuje se používat mladé listy.Použijte děrovačku s pevným průměrem 0,5 – 3 mm, abyste získali malý a jednotný vzoreka, a poté přidejte vzorek přímo do systému PCR (doporučuje se 50 μl systém).Poznámka: Ujistěte se, že vzorek je v roztoku PCR a ne proti stěně zkumavky.Pokud se k amplifikaci dlouhých fragmentů a komplexních vzorků používá přímá PCR, může použití vzorku s menším průměrem (0,5 – 1 mm) jako templátu pomoci k dosažení lepších výsledků.

Metoda lýzy mletím:Doporučuje se používat mladé listy.Vezměte malý kousek listu (asi 1 – 3 mm v průměru), vložte jej do 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab a rozdrťte jej co nejvíce (tento krok lze provést zmáčknutím listu špičkou 100 μl pipety rozdrtit vzorek).Pokud jsou použity větší objemy pletiva listů (nepřesahují 7 mm), zvyšte objem ředicího pufru na 50 μl.Po rozemletí listů by měl roztok vypadat zeleně.Po krátké centrifugaci přidejte 1 μl supernatantu do systému PCR jako reakční templátc .

Metoda tepelné lýzy:Doporučuje se používat mladé listy.Vezměte malý kousek listu (asi 1 – 3 mm v průměru), vložte jej do 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A a zahřívejte na 95 °C po dobu 5 – 10 minut.U listů, které se obtížně lyzují, lze dobu lýzy vhodně prodloužit (ne více než 20 minut).Pokud jsou použity větší objemy pletiva listů (nepřesahují 7 mm), zvyšte objem ředicího pufru na 50 μl.Po zahřátí krátce centrifugujte a přidejte 1 μl supernatantu do systému PCR jako reakční šablonub.

Zpracování vzorku– Semena rostlin

Metoda lýzy mletím:Skalpelem nakrájejte semena o průměru 5 mm, přidejte je do 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A a vzorek rozetřete špičkou pipety nebo jinými nástroji.Krátce promíchejte na vortexu a nechte 3 – 5 minut stát při pokojové teplotě.Ujistěte se, že je vzorek semen ponořen v ředicím pufru.Po krátké centrifugaci přidejte 1 μl supernatantu do systému PCR jako reakční šablonu.

Metoda tepelné lýzy:Skalpelem nakrájejte semínka o průměru 5 mm, přidejte je do 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A a zahřívejte na 95°C po dobu 5 – 10 min.U listů, které se obtížně lyzují, lze dobu lýzy vhodně prodloužit (ne více než 30 minut).Po zahřátí krátce centrifugujte a přidejte 1 μl supernatantu do systému PCR jako reakční šablonub.

A.K řezání vzorků vhodné velikosti lze také použít nůžky nebo jiné nástroje;pokud se děrovač nebo nůžky znovu použijí, měly by být před každým použitím vyčištěny 2% roztokem chlornanu sodného, ​​aby se zabránilo křížové kontaminaci mezi vzorky.

b.Před použitím se ujistěte, že je Plant Direct Lysis Buffer úplně rozpuštěný.Pokud je pufr viskózní nebo obsahuje sraženiny, lze jej před použitím zahřát na 37 °C, aby se úplně roztavil.

C.Objem templátu v reakčním systému lze vhodně upravit podle rozdílu v objemu rostlinného materiálu a přidaného ředidla.

Plant Direct Lysis Buffer

Plant Direct Lysis Buffer A obsažený v tomto produktu byl přísně optimalizován tak, aby uvolnil genom většiny rostlinných tkání a je vhodný pro krátkodobé skladování surových rostlin při 4 °C.Pokud je třeba vzorek skladovat po delší dobu (např. 1 – 2 měsíce), doporučuje se přenést supernatant do nové EP zkumavky a skladovat při -20 °C.Pro stabilnější skladování vzorků přidejte stejný objem Plant Direct Lysis Buffer B k přenesenému supernatantu, dobře promíchejte a skladujte při -20 °C.Stabilní doba skladování se liší podle vzorků a stavu rostlin.

Reakční systém

A.Obsahuje Mg²⁺v konečné koncentraci 2 mM.

b.Pro každý primer se doporučuje použít konečnou koncentraci 0,4 μM.Nadměrné použití primerů povede ke zvýšené nespecifické amplifikaci.

C.Množství použitého vzorku lze upravit podle aktuální situace.Množství použité v jedné reakci surového lyžovaného vzorku lze upravit v rozmezí 2 % – 20 % z celkového objemu reakce.Použití příliš velkého množství vzorků může způsobit selhání amplifikace.

Program reakce

A.Počáteční denaturace (98℃, 5 min) podporuje lýzu rostlinné tkáně a uvolňuje genomovou DNA, kterou lze použít pro PCR amplifikaci.Nezkracujte čas ani nesnižujte teplotu.

b.Doporučuje se nastavit ji na hodnotu Tm základního nátěru nebo o 2 ~ 4℃ vyšší než je hodnota Tm.Přímá amplifikační DNA polymeráza použitá v tomto produktu se liší od konvenční Taq DNA polymerázy a má speciální požadavky na reakční teplotu nasedání; použití vysoké teploty nasedání může účinně snížit nespecifickou amplifikaci a zlepšit účinnost amplifikace.U složitých šablon lze účinné amplifikace dosáhnout úpravou teploty žíhání a prodloužením doby extenze.

C.Pokud je délka amplifikačního produktu ≤ 1 kb, je doba extenze nastavena na 30 s/kb;pokud je délka amplifikačního produktu >1 kb, doba extenze je nastavena na 60 s/kb.

d.U komplexních vzorků nebo vzorků s nízkým výtěžkem amplifikace lze počet cyklů vhodně zvýšit na 40 - 50 cyklů.

Aplikace

Je použitelný pro přímou amplifikaci rostlinných pletiv a vysoce výkonný screening rostlinných vzorků, které neobsahují polysacharidy a polyfenoly.

Poznámky

Pouze pro výzkumné použití.Není určeno pro diagnostické postupy.

1. Pro amplifikaci surové rostliny nebo přímou amplifikaci se doporučuje použít purifikovanou genomickou DNA jako pozitivní kontrolu před zahájením experimentu, aby bylo zajištěno, že systém, primery a operace jsou správné.

2. Přímá amplifikace DNA polymerázy použitá v této soupravě má ​​silnou korekční aktivitu.Pokud je třeba provést klonování TA, doporučuje se před přidáním adeninu purifikovat DNA.

3. Pokyny pro návrh primeru:

A.Doporučuje se, aby poslední báze na 3′ konci primeru byla G nebo C.

b.Je třeba se vyhnout následným neshodám v posledních 8 bázích na 3′ konci primeru.C.Vyvarujte se vlásenkových struktur na 3′ konci základního nátěru.

d.Rozdíly v hodnotě Tm dopředného primeru a reverzního primeru by neměly být větší než 1 °C a hodnota Tm by měla být upravena na 60 ~ 72 °C (pro výpočet hodnoty Tm se doporučuje Primer Premier 5).

E.Dodatečné sekvence primerů, které se neshodují s templátem, by neměly být zahrnuty při výpočtu hodnoty Tm primeru.

F.Doporučuje se, aby obsah GC v základním nátěru byl 40% -60%.

G.Celková distribuce A, G, C a T v primeru by měla být co nejrovnoměrnější.Nepoužívejte oblasti s vysokým obsahem GC nebo AT.

h.Vyhněte se přítomnosti komplementárních sekvencí o 5 nebo více bázích buď v primeru nebo mezi dvěma primery a vyhněte se přítomnosti komplementárních sekvencí o 3 nebo více bázích na 3' konci dvou primerů.

i.Použijte funkci NCBI BLAST ke kontrole specifičnosti primeru, abyste zabránili nespecifické amplifikaci.