Proteináza K mNGS (tekutá)
Proteináza K je stabilní serinová proteáza se širokou substrátovou specifitou.Rozkládá mnoho proteinů v nativním stavu i za přítomnosti detergentů.Důkazy ze studií krystalové a molekulární struktury naznačují, že enzym patří do rodiny subtilisinů s aktivním místem katalytické triády (Asp39-Jeho69-Ser224).Převládajícím místem štěpení je peptidová vazba sousedící s karboxylovou skupinou alifatických a aromatických aminokyselin s blokovanými alfa aminoskupinami.Běžně se používá pro svou širokou specifičnost.Tato proteináza K je speciálně navržena pro mNGS.Ve srovnání s jinou proteinázou K obsahuje ještě méně kontaminace nukleovými kyselinami se stejným enzymatickým výkonem, což by mohlo lépe zajistit následnou aplikaci mNGS.
Podmínky skladování
2-8 ℃ po dobu 2 let
Specifikace
| Vzhled | Bezbarvá až světle hnědá kapalina |
| Aktivita | ≥800 U/ml |
| Koncentrace bílkovin | >20 mg/ml |
| Nickase | Nebyla zjištěna žádná |
| DNase | Nebyla zjištěna žádná |
| RNáza | Nebyla zjištěna žádná |
Vlastnosti
| EC číslo | 3.4.21.64(Rekombinant z alba Tritirachium) |
| Izoelektrický bod | 7,81 |
| Optimální pH | 7,0- 12,0 Obr |
| Optimální teplota | 65 ℃ Obr. 2 |
| pH stabilita | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Obr. 3 |
| Tepelná stabilita | Pod 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Obr |
| Stabilita při skladování | Více než 90% aktivita po dobu 12 měsíců při 25 ℃ |
| Aktivátory | SDS, močovina |
| Inhibitory | diisopropylfluorfosfát;fenylmethylsulfonylfluorid |
Aplikace
1. Genetická diagnostická souprava
2. Soupravy pro extrakci RNA a DNA
3. Extrakce nebílkovinných složek z tkání, degradace proteinových nečistot, např. DNAvakcíny a příprava heparinu
4. Příprava chromozomové DNA pulzní elektroforézou
5. Western blot
6. Enzymatická glykosylovaná albuminová činidla in vitro diagnostika
Opatření
Při používání nebo vážení používejte ochranné rukavice a brýle a po použití dobře větrejte.Tento produkt může způsobit kožní alergickou reakci a vážné podráždění očí.Při vdechnutí může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dušnost.Může způsobit podráždění dýchacích cest.
Definice jednotky
Jedna jednotka (U) je definována jako množství enzymu potřebného k hydrolýze kaseinu za vzniku 1 μmoltyrosinu za minutu za následujících podmínek.
Příprava činidel
Činidlo I: 1 g mléčného kaseinu byl rozpuštěn v 50 ml 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 8,0), inkubován v 65-70 °C vody po dobu 15 minut, míchán a rozpuštěn, ochlazen vodou, upraveno hydroxidem sodným na pH 8,0 a fixován objem 100 ml.
Činidlo II: 0,1M kyselina trichloroctová, 0,2M octan sodný, 0,3M kyselina octová.
Činidlo III: 0,4M Na2CO3řešení.
Reagent IV: Forintovo činidlo zředěné čistou vodou 5krát.
Reagent V: Enzymové ředidlo: 0,1M roztok fosforečnanu sodného (pH 8,0).
Činidlo VI: tyrosinový roztok: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosinu rozpuštěný s 0,2M HCl.
Postup
1. 0,5 ml činidla I se předehřeje na 37 °C, přidá se 0,5 ml roztoku enzymu, dobře se promíchá a inkubuje se při37 °C po dobu 10 minut.
2. Přidejte 1 ml činidla II pro zastavení reakce, dobře promíchejte a pokračujte v inkubaci po dobu 30 minut.
3. Centrifugujte reakční roztok.
4. Vezměte 0,5 ml supernatantu, přidejte 2,5 ml činidla III, 0,5 ml činidla IV, dobře promíchejte a inkubujte při 37 °Cpo dobu 30 min.
5. OD660byla stanovena jako OD1;slepá kontrolní skupina: 0,5 ml činidla V se používá k nahrazení enzymuřešení pro stanovení OD660jako OD2, AOD=OD1-OD2.
6. Standardní křivka L-tyrosinu: 0,5 ml různé koncentrace roztoku L-tyrosinu, 2,5 ml činidla III, 0,5 ml činidla IV v 5 ml centrifugační zkumavce, inkubace při 37 °C po dobu 30 minut, detekce OD660pro různé koncentrace L-tyrosinu, pak získal standardní křivku Y=kX+b, kde Y je koncentrace L-tyrosinu, X je OD600.
Výpočet
2: Celkový objem reakčního roztoku (ml)
0,5: Objem roztoku enzymu (ml)
0,5: Objem reakční kapaliny použitý při chromogenním stanovení (ml)
10: Reakční doba (min)
Df: Vícenásobné ředění
C: Koncentrace enzymu (mg/ml)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.a spol.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Postavy
Obr.1 Optimální pH
100 mM roztok pufru: pH 6,0-8,0, Na-fosfát;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH. Koncentrace enzymu: 1 mg/ml
Obr.2 Optimální teplota
Reakce ve 20 mM K-fosfátovém pufru pH 8,0.Koncentrace enzymu: 1 mg/ml
Obr.3 pH Stabilita
25 °C, 16 h-ošetření 50 mM roztokem pufru: pH 4,5-5,5, acetát;pH 6,0-8,0, fosforečnan sodný;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH.Koncentrace enzymu: 1 mg/ml
Obr.4 Tepelné stabilita
30 min. ošetření 50 mM Tris-HCl pufrem, pH 8,0.Koncentrace enzymu: 1 mg/ml
Obr.5 Skladování stabilizovatty at 25℃
