Univerzální SYBR GREEN qPCR Premix (modrý)
Kat. číslo: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Dye Based) je pre-roztok pro 2× kvantitativní PCR amplifikaci v reálném čase vyznačující se vysokou citlivostí a specificitou, má modrou barvu a má efekt sledování přidání vzorku.Základní složka Taq DNA polymeráza využívá protilátkový horký start k účinné inhibici nespecifické amplifikace v důsledku nasedání primeru během přípravy vzorku.Současně vzorec přidává podpůrné faktory pro zlepšení účinnosti amplifikace PCR reakce a vyrovná amplifikaci genů s různým obsahem GC (30 ~ 70 %), takže kvantitativní PCR může získat dobrý lineární vztah v širokém kvantitativním kraj.Tento produkt obsahuje speciální pasivní referenční barvivo ROX, které je použitelné pro většinu přístrojů qPCR.Není nutné upravovat koncentraci ROX na různých nástrojích.Je pouze nutné přidat primery a templáty pro přípravu reakčního systému pro amplifikaci.
Komponenty
Univerzální modrá qPCR Master Mix
Podmínky skladování
Výrobek je dodáván s ledovými balíčky a může být skladován při teplotě -25℃~-15℃ po dobu 18 měsíců.Při skladování nebo přípravě reakčního systému je nutné se vyvarovat silného světelného záření.
Specifikace
| Koncentrace | 2× |
| Metoda detekce | SYBR |
| PCR metoda | qPCR |
| Polymeráza | Taq DNA polymeráza |
| Typ vzorku | DNA |
| Aplikační zařízení | Většina přístrojů qPCR |
| Typ produktu | SYBR premix pro fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase |
| Použít na (aplikaci) | Genová exprese |
Instrukce
1.Reakční systém
| Komponenty | Objem (μL) | Objem (μL) | Závěrečné soustředění |
| Univerzální SYBR GREEN qPCR Premix | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/l |
| Reverzní primer (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/l |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | až 50 | až 20 | - |
[Poznámka]: Před použitím důkladně promíchejte, aby se předešlo nadměrným bublinám při intenzivním protřepávání.
a) Koncentrace primeru: Konečná koncentrace primeru je 0,2 μmol/l a lze ji také upravit mezi 0,1 a 1,0 μmol/l podle potřeby.
b) Koncentrace templátu: Pokud je templátem neředěný zásobní roztok cDNA, použitý objem by neměl překročit 1/10 celkového objemu reakce qPCR.
c) Ředění šablony: Zásobní roztok cDNA se doporučuje naředit 5-10krát.Optimální množství přidaného templátu je lepší, když je hodnota Ct získaná amplifikací 20-30 cyklů.
d) Reakční systém: Pro zajištění účinnosti a opakovatelnosti amplifikace cílového genu se doporučuje použít 20μL nebo 50μL.
e) Příprava systému: Připravte se na super čistém stole a použijte špičky a reakční zkumavky bez zbytků nukleázy;doporučuje se používat hroty s filtračními patronami.Zabraňte křížové kontaminaci a kontaminaci aerosolem.
2.Program reakce
Standardní program
| Krok cyklu | Temp. | Čas | Cykly |
| Počáteční denaturace | 95℃ | 2 min | 1 |
| Denaturace | 95℃ | 10 sec | 40 |
| Žíhání/prodlužování | 60℃ | 30 sekund★ | |
| Fáze křivky tání | Výchozí nastavení přístroje | 1 | |
Rychlý program
| Krok cyklu | Temp. | Čas | Cykly |
| Počáteční denaturace | 95℃ | 30 sec | 1 |
| Denaturace | 95℃ | 3 sec | 40 |
| Žíhání/prodlužování | 60℃ | 20 sekund★ | |
| Fáze křivky tání | Výchozí nastavení přístroje | 1 | |
[Poznámka]: Rychlý program je vhodný pro velkou většinu genů a standardní programy lze vyzkoušet pro jednotlivé komplexní geny sekundární struktury.
a) Teplota a čas nasedání: Upravte prosím podle délky primeru a cílového genu.
b) Získání fluorescenčního signálu (★): Nastavte prosím experimentální postup podle požadavků v návodu k použití přístroje.
c) Křivka tání: Standardní program přístroje lze použít normálně.
3. Analýza výsledků
Pro kvantitativní experimenty byly vyžadovány minimálně tři biologické replikáty.Po reakci je třeba potvrdit amplifikační křivku a křivku tání.
3.1 Křivka zesílení:
Standardní amplifikační křivka má tvar S.Kvantitativní analýza je nejpřesnější, když hodnota Ct klesne mezi 20 a 30. Pokud je hodnota Ct menší než 10, je nutné šablonu naředit a provést test znovu.Když je hodnota Ct mezi 30-35, je nutné zvýšit koncentraci templátu nebo objem reakčního systému, aby se zlepšila účinnost amplifikace a zajistila se přesnost analýzy výsledků.Když je hodnota Ct vyšší než 35, výsledky testu nemohou kvantitativně analyzovat expresi genu, ale mohou být použity pro kvalitativní analýzu.
3.2 Křivka tání:
Jediný pík křivky tání ukazuje, že reakční specificita je dobrá a lze provést kvantitativní analýzu;jestliže křivka tání vykazuje dvojité nebo vícenásobné píky, nelze provést kvantitativní analýzu.Křivka tání ukazuje dvojité píky a je nutné posoudit, zda necílový pík je primer dimer nebo nespecifická amplifikace pomocí DNA agarózové gelové elektroforézy.Pokud se jedná o primer dimer, doporučuje se snížit koncentraci primeru nebo přepracovat primery s vysokou účinností amplifikace.Pokud se jedná o nespecifickou amplifikaci, zvyšte teplotu nasedání nebo přepracujte primery se specificitou.
Poznámky
Používejte prosím nezbytné OOP, jako je laboratorní plášť a rukavice, abyste zajistili své zdraví a bezpečnost！
Tento produkt je určen POUZE pro výzkumné účely!
