Uracilová DNA glykosyláza
Uracil-DNA glykosyláza (UNG nebo UDG) je rekombinantní klon E. coli s molekulovou hmotností 25 kDa.Katalyzuje uvolňování volného uracilu z jednořetězcové a dvouřetězcové DNA obsahující uracil a je neaktivní vůči RNA a lze jej použít k zabránění kontaminace produktů PCR amplifikace.Princip účinku je založen na skutečnosti, že pokud se v PCR reakci nahradí dUTP dTTP a vznikne amplifikační produkt PCR obsahující báze dU, může enzym selektivně rozbít glykosidickou vazbu U bází v jednovláknové a dvouvláknové DNA a degradovat produkt PCR amplifikace.
Doporučená aplikace
Zesilování prevence kontaminace
Skladovací stav
-20°C pro dlouhodobé skladování, před použitím je třeba dobře promíchat, vyhnout se častému zmrazování a rozmrazování.
Vyrovnávací paměť úložiště
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizátor, 50 % glycerol.
Definice jednotky
Množství enzymu potřebné k degradaci 1 ug jednovláknové DNA obsahující dU báze za 1 hodinu při 37 °C je 1 jednotka.
Kontrola kvality
1.Elektroforetická čistota SDS-PAGE vyšší než 98 %
2.Citlivost zesílení, kontrola jednotlivých dávek, stabilita
3.Po ošetření 1U UNG při 50 °C po dobu 2 minut by měla být šablona obsahující U pod 103 kopií zcela degradována a nelze vytvořit žádný amplifikační produkt.
4.Žádná exogenní nukleázová aktivita
Instrukce
| Komponenty | Objem (μL) | Závěrečné soustředění |
| 10 × PCR pufr (bez dNTP, Mg2+volný, uvolnit) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 uM |
| dUTP (nahradit dTTP) | - | 200-600 uM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μl | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1–0,5) |
| 25 × základní směsA | 2 | 1× |
| Šablona | - | ＜1 μg/reakci |
| ddH20 | Do 50 | - |
Poznámka: a: Při použití pro qPCR/qRT-PCR by měla být fluorescenční sonda přidána do reakčního systému.Obvykle může poskytnout dobré výsledky konečná koncentrace primeru 0,2 μM;když je reakční výkon špatný, lze koncentraci primeru upravit v rozsahu 0,2-1 μM.Obvykle je koncentrace sondy optimalizována v rozmezí 0,1-0,3 μM.K nalezení nejlepší kombinace primeru a sondy lze provést experimenty s koncentračním gradientem.
Poznámky
1.Enzym UNG lze použít k odstranění kontaminovaných produktů amplifikace dUTP z reakčního systému před amplifikační reakcí PCR, aby se zabránilo falešně pozitivním výsledkům v důsledku kontaminace produktu.
2.Optimální teplota pro enzym UNG pro použití v anti-kontaminační PCR reakci je obecně 50 °C po dobu 2 minut;podmínka deaktivace je 95 °C po dobu 5 minut.
3.Vyhněte se častému zmrazování a rozmrazování a nevystavujte velkým teplotním výkyvům.
4.Různé geny, které mají být amplifikovány, mají různou účinnost využití dUTP a citlivost na enzym UNG, proto pokud použití systému UNG vede ke snížení citlivosti detekce, měl by být reakční systém upraven a optimalizován, pokud potřebujete technickou podporu, kontaktujte naše společnost.
