RTL reverzní transkriptáza
RTL reverzní transkriptáza je DNA polymeráza závislá na templátu RNA, která postrádá 3'→5' exonukleázovou aktivitu a má aktivitu RNázy H.Tento enzym může použít RNA jako templát k syntéze komplementárního řetězce DNA, který může být aplikován na syntézu prvního vlákna cDNA, zejména pro RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).Ve srovnání s RTL reverzní transkriptázou 1.0 je citlivost výrazně zlepšena, tepelná stabilita je silnější a reakce při 65 °C je stabilnější.RTL reverzní transkriptázu (bez glycerolu) lze použít k přípravě lyofilizovaných přípravků, lyofilizovaných činidel RT-LAMP atd.
Definice jednotky
Jedna jednotka inkorporuje 1 nmol dTTP do materiálu vysráženého kyselinou za 20 minut při 50 °C s použitím poly(A)•oligo(dT)25 jako templátového primeru.
Komponenty
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reverzní transkriptáza (bez glycerolu) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL vyrovnávací paměť | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgS04 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Skladovací stav
Přepravujte při teplotě 0°C a skladujte při -25°C~-15°C.
Kontrola kvality
- Zbytková aktivitaEndonukleáza:50 ul reakce obsahující 1 ug λDNA a 15 jednotek RTL2.0 inkubovaná po dobu 16 hodin při 37 °C vykazuje stejný profil jako negativní kontrola gelovou elektroforézou.
- Zbytková aktivitaExonukleáza:50 ul reakce obsahující 1 ug HindⅢ štěpené ADNA a 15 jednotek RTL2.0 inkubované po dobu 16 hodin při 37 °C vykazuje stejný vzor jako negativní kontrola gelovou elektroforézou.
- Zbytková aktivitaNickase:50 ul reakce obsahující 1 ug nadšroubovicového pBR322 a 15 jednotek RTL2.0 inkubovaných po dobu 4 hodin při 37 °C vykazuje stejný vzor jako negativní kontrola gelovou elektroforézou.
- Zbytková aktivitaRNáza:10 μl reakce obsahující 0,48 μg MS2 RNA a 15 jednotek RTL2.0 inkubovaná po dobu 4 hodin při 37 °C vykazuje stejný vzor jako negativní kontrola gelovou elektroforézou.
- E-coli gDNA:Měřeno sE-colispecifické soupravy pro detekci HCD, 15 jednotek RTL2.0 obsahuje méně než 1E-coligenom.
Nastavení reakce
Protokol syntézy cDNA
| Komponenty | Hlasitost |
| Template RNA a | volitelný |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) nebo Random Primer mix (60uM) | 2 μl |
| dNTP Mix (10 mM každý) | 1 μl |
| Inhibitor RNázy (40U/ul) | 0,5 μl |
| RTL reverzní transkriptáza 2.0 (15U/ul) | 0,5 μl |
| 10×HC RTL vyrovnávací paměť | 2 μl |
| Voda bez nukleázy | Až 20 μl |
Poznámky:
1) Doporučená dávka celkové RNA je 1ng~1μg
2) Doporučená dávka mRNA byla 50 ng~100 ng
Termo-cyklistika Podmínky pro rutinu reakce:
| Teplota (°C) | Čas |
| 25 °Ca | 5 minut |
| 55 °C | 10 minutb |
| 80 °C | 10 minut |
Poznámky:
1) Pokud se použije Random Primer Mix, inkubační krok při 25 °C.
2) Pokud je použita cílová směs primerů, inkubace při 55 °C po dobu 10~30 minut.
Protokol RT-LAMP
| Komponenty | Hlasitost | Závěrečné soustředění |
| Template RNA | volitelný | ≥10 kopií |
| dNTP Mix (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mM |
| Základní nátěry FIP/BIP (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| Základní nátěry F3/B3 (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| Primery LoopF/LoopB (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| Inhibitor RNázy (40 U/μL) | 0,5 μl | 20 U/reakce |
| RTL reverzní transkriptáza 2.0 (15U/μL) | 0,5 μl | 7,5 U/reakce |
| Bst V2 DNA polymeráza (8U/μL) | 1 μl | 8 U/reakce |
| MgS04 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (celkem 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (nebo 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Voda bez nukleázy | Až 25 μl | - |
Poznámky:
1) Promíchejte vortexováním a krátce odstřeďte, aby se shromáždil.Inkubace při konstantní teplotě při 65 °C po dobu 1 hodiny.
2) Tyto dva buffery jsou interoperabilní a mají stejné složení.
Poznámky
1. Tento produkt vytvoří při skladování při -20 °C bílou pevnou látku.Vyjmeme z -20°C a dáme na cca 10 minut k ledu.Po roztavení lze použít protřepáním a promícháním.
2. Produkt cDNA by mohl být skladován při -20 °C nebo -80 °C nebo okamžitě použit pro PCR reakci.
3.Abyste zabránili kontaminaci RNázou, udržujte experimentální oblast čistou a během provozu používejte čisté rukavice a masky.
